通过体外转录（IVT）获得的mRNA样品，其反应混合物中不仅富含目标mRNA产物，也夹杂了各种杂质，如T7 RNA聚合酶、无机焦磷酸酶、NTP、模板DNA、盐离子以及在IVT过程中生成的mRNA副产物（如dsRNA和短链转录本）。这些杂质可能会显著妨碍mRNA的功能，例如影响其准确计量、降低翻译效率或改变免疫原性。因此，将目标mRNA从IVT混合物中有效分离并进行纯化，是确保其纯度、完整性及最终产品安全性与有效性的关键步骤。

常见的mRNA纯化方法

目前常用的mRNA纯化技术包括氯化锂（LiCl）沉淀、硫酸铵沉淀、磁珠纯化、硅胶柱膜纯化以及层析纯化等。其中，沉淀、磁珠和硅胶柱法操作简单且快速，但对于大规模工业应用而言，层析纯化更为主流。在2024年1月，中科院过程工程研究所的张松平团队发表了一篇题为《Rapid and high recovery isolation of mRNA from in vitro transcription system by ammonium sulphate precipitation at room temperature》的论文，探讨了硫酸铵沉淀法的可行性。研究中发现，当硫酸铵浓度达到18M时，mRNA的沉淀率超过95%。同时，沉淀物在室温下可迅速溶解，溶解率超过90%。最佳沉淀条件为2M硫酸铵（AS）、pH 7.0、温度20℃，沉淀时间2小时，此时可以实现接近100%的沉淀率与溶出率。

硫酸铵与LiCl沉淀法的比较

硫酸铵和LiCl沉淀法对NTP的去除率均高于99%，而DNA模板的去除率分别约为82%和85%。不过，在温度上，硫酸铵沉淀法更具优势，能够在室温下进行，这为产量放大提供了便利。

硅胶柱膜纯化的优势

硅胶柱膜纯化基于硅胶膜表面硅醇基团与mRNA分子的相互作用。硅胶膜在高盐环境中能够中和与mRNA的静电排斥，促进结合，而在低盐状态下，mRNA得以释放。该方法安全无毒，符合环保标准，有助于保护实验人员的健康。因此，不朽情缘MG推荐科研和早研阶段广泛采用这种高效、简便的纯化方式。

层析法的应用前景

工业级的mRNA纯化通常采用层析法，以更高的核酸质量及产能水平为目标。目前主流的方法是Oligo(dT)亲和色谱，结合疏水层析和阴离子层析等技术实现有效分离。Oligo(dT)柱在高盐条件下能有效结合mRNA，而在洗脱时又可顺利去除不具Poly(A)尾的杂质，如游离核苷酸和短链转录本。这些策略在提供高纯度mRNA的同时，保障了产品的安全性与有效性。

转化工程与安全性考量

在流水线上，许多mRNA纯化工艺采取TFF1-层析-TFF2的流程，旨在去除杂质并置换缓冲体系。随着对蛋白酶K等去除策略的研究深入，不朽情缘MG正在优化其添加量，以确保mRNA的完整性和安全性。此外，正在积极开发用于检测蛋白酶K残留的试剂盒，以期进一步提升mRNA疫苗的安全标准。

不朽情缘MG的解决方案

不朽情缘MG致力于开发一系列高性能酶原料、化学底物、IVT试剂盒及质控试剂盒，能够为客户提供全面的工艺开发服务，支持快速推进新药研发。我们为早研阶段的客户提供CRO服务、概念验证服务以及第三方质检服务，涵盖报告基因、靶点蛋白等多种产品。

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